Ана была единственной дочерью в одной из самых знатных семей Испании. Известно, что родители девочки плохо между собой ладили, и когда дочь вышла замуж стали жить отдельно друг от друга. С детства Ана носила черную повязку, считалось что виной потери глаза несчастный случай на уроке фехтования. Но есть версии, что таким образом красавица хотела скрыть единственный свой недостаток - косоглазие.
В 1553 году 13 летней Ане наследный принц Филипп подыскал жениха. Португалец Руй Гомес де Сильва не был так знатен как семья невесты, к тому же он был старше невесты на 23 года, но он был фаворитом принца. Филипп обещал молодым супругам приличную ежегодную денежную выплату, а так же титулы принца и принцессы Эболи. Наследник испанского престола лично был свидетелем на помолвке Аны и Руя. А сам брак был заключен согласно брачному договору в 1553 году, причем сам жених отсутствовал, так как он сопровождал Филиппа женившегося на королеве Англии Марии I Тюдор.
Фактически брак был осуществлен лишь через два года. Через год Ана родила их первого сына Диего. Супружеский союз был весьма плодовитым, всего в браке родилось десять детей. Постепенно влияние Руя на короля Филиппа ослабло, и он с семьей перебрался в принадлежащий ему город Пастрана, где занялся производством шелка. Ана же основала несколько монастырей и пригласила в город Терезу Авильскую, в последствии причисленную к лику святых. Однако в 1573 году Руй Гомес ушел из жизни, оставив после себя огромные долги. Молодая вдова решила отправиться в монастырь, но пробыла там недолго.
Ана демонстративно переехала в монастырь, но жить в смирении явно не входило в её планы. Она распоряжалась монашками как своими служанками, частые гости принцессы мешали послушницам вести обычный образ жизни. И даже просили короля убедить Ану покинуть монастырь. но то была непреклонна. Не выдержав обитательницы монастыря покинули его сами, лишь после этого принцесса вернулась к мирской жизни. В 1577 году король повелевает Ане де Мендоса прибыть ко двору.
Считается, что принцесса Эболи была фавориткой короля Испании, и призвал он её приехать в Мадрид, чтобы беспрепятственно встречаться со своей возлюбленной. Однако при дворе она начала плести интриги вместе с секретарем короля Антонио Пересем, которого называли возможным внебрачным сыном её покойного мужа Руя. Ана и Антонио настроили короля против своего недруга Хуана де Эскобедо, и заручились согласием Филиппа на устранение Хуана. Когда же дело было сделано, король понял, что Эскобедо оговорили, к тому же он узнал о любовной связи принцессы Эболи и Переса.
Разгневанный Филипп приказ арестовать обоих предателей. Антонио Перес вскоре сбежал во Францию, а Ана заточена в комнате своего замка в Пастране, где под самым строгим контролем прожила одиннадцать лет. Принцесса Эболи ушла из жизни в 1592 году, в возрасте 51 года.