Предки Лефорта переселились в Женеву в XVI в. из Пьемонта, вели крупную москательную торговлю в различных государствах и занимали видные посты в правительстве Женевской республики. Лефорт обучался в кальвинистском коллегиуме и, по семейной традиции, готовился к коммерческой деятельности, но в 1675 покинул Женеву и отправился в Голландию. Находясь в свите наследного принца Курляндского Фридриха Казимира, участвовал в войне Голландии против Франции. По окончании войны Лефорт вступил в отряд голландского полковника ван Фростена, с которым направился на службу в Россию. В августе 1675 отряд высадился в Архангельске, в начале 1676 прибыл в Москву, но на русскую службу принят не был и распался. Лефорт остался в Москве и поселился в Немецкой слободе.
В 1678 зачислен на русскую службу в чине капитана. В начале 1679 направлен в киевский гарнизон под начало князя В.В. Голицына и генерал-майора П.И. Гордона. Командовал ротой, участвовал в многочисленных стычках с крымскими татарами. Вернувшись в Москву в 1683 после кратковеременного отпуска в Женеве, Лефорт до осени 1685 выполнял различные дипломатические поручения. Его дом постепенно превратился в центр Немецкой слободы; в нем собирались не только ее жители, но и представители русской знати, в частности князья В.В. и Б.А. Голицыны. Осенью 1685 Лефорт вернулся в Киев; участвовал в Крымских походах 1687 и 1689, командуя батальоном. По одной из версий, в 1689 Лефорт был в числе первых, кто перешел с войсками на сторону Петра I в период его конфликта с царевной Софьей. С 1690 генерал-майор. Петр I, с весны 1690 регулярно посещавший Немецкую слободу, в сентябре впервые посетил дом Лефорта и вскоре сблизился с ним. Франц Лефорт стал одним из главных организаторов и участников военных «потех» Петра I; в 1691 произведен в генерал-лейтенанты, в 1693 — в полные генералы. С 1691 командовал полком, для размещения которого выстроил слободу на левом берегу Яузы, получившую название Лефортовской (отсюда название местности — Лефортово). В 1691-1694 сопровождал Петра I в поездках на Плещее-во озеро в Переславль-Залесский, на Кубенское озеро, в Архангельск и на Белое море. В то же время Лефорт занимался наймом на русскую службу военных и морских специалистов, используя при этом свои связи в Западной Европе.
В 1-м Азовском походе 1695 Лефорт — один из трех (наряду с Гордоном и A.M. Головиным) командующих русскими войсками, сторонник быстрого штурма Азова. Во 2-м Азовском походе 1696 Лефорт командовал флотом; после взятия Азова Петр I пожаловал ему деревню Богоявленскую Епифанского уезда и назначил его новгородским наместником. Возглавлял Великое посольство 1697-1698 (по мнению многих современников и историков, его главный инициатор); «младшими» послами были Ф.А. Головин и П.Б. Возницын. Как глава посольства Лефорт формально вел все переговоры и подписывал важнейшие документы; в то же время он знакомил Петра со странами Европы, занимался наймом специалистов для русского флота и финансировал закупку корабельного снаряжения. После известия о стрелецком мятеже 1698 сопровождал Петра I в Москву, но от личного участия в казнях стрельцов уклонился. В 1698 Лефорт поселился в отстроенном для него дворце на Яузе (с 1865 в нем находился Лефортовский архив). Лефортовский дворец стал своеобразным центром русской политической и придворной жизни 1698-1699; здесь происходили все важнейшие встречи Петра I и многочисленные придворные праздники. Лефорт умер скоропостижно, от простуды. Петр I устроил ему пышные похороны. Среди петровских «птенцов» Лефорт выделялся расточительностью, оставив огромные долги (около 6 тыс. руб.), которые уплатил царь. После смерти Лефорта его дворец перешел к А.Д. Меншикову. По настоянию Петра I сын Лефорта — Анри приехал в Россию из Женевы и до своей смерти (1702) неотлучно находился при царе.