Ремеслу юный Синьорини учился во Флоренции, поступив в Академию художеств. Там молодой человек быстро нашел единомышленников и влился в компанию талантливых мастеров, среди которых были Фаттори, Сильвестро Лега, Боррани и Чечони. Вместе с ними он создал группу «Маккьяйоли» и стал ее духовным наставником. Позднее студенческий союз перерос в крупное художественно-выставочное объединение, которое получило название «Школа маккьяйоли».
Еще в годы учебы в Академии художеств Телемако Синьорини открыто заявил о своих республиканских взглядах и стал членом революционного кружка, который возглавлял Джузеппе Мадзини. Нельзя сказать, что его политические убеждения никак не отразились в творчестве. На протяжении нескольких лет художник был предан только искусству и политике. Он участвовал в походе Гарибальди, и воспоминания об этом времени впоследствии стали сюжетами его произведений.
Картины Телемако Синьорини представил в 1861 году на Всеитальянской выставке во Флоренции, на которой выступал вместе с остальными мастерами «Школы маккьяйоли». Его ранние работы, среди которых была написанная за два года до выставки картина «Миланский Дуомо», не только принесли автору первые награды и славу, но и стали его попыткой отказаться от традиций, навязанных академической исторической живописью.
В этом же духе борьбы с классическими канонами были написаны в разное время картины «Флорентийское гетто» и «Понте-Веккьо во Флоренции», на которых художник с тонким лиризмом и детальностью изобразил повседневный быт жителей бедных флорентийских кварталов. Сегодня принято считать, что сюжеты именно этих работ стояли у истоков неореалистического итальянского кино XX века.
Художник путешествовал по стране на протяжении долгих десяти лет. Гуляя по побережью Лигурии, кварталам Тосканы Виареджо и другим итальянским городам, мастер искал и находил сюжеты для будущих произведений. На картинах этого периода Синьорини изображал итальянские улицы и площади, а игрой света и тени добавлял этим полотнам ощущение уюта и сценичности городского быта, что позднее нашло свое отражение в картинах мастера. Более насыщенная композиция и сложный сюжет у полотна «Волнение. В приюте Св. Бонифация для умалишенных», на которых мастер изобразил то, что было скрыто от глаз простых обывателей.
Примерно в 1880 году Синьорини познакомился с творчеством французских импрессионистов и увлекся изображением городских пейзажей в свойственной им манере. Поэтому картина «Сентябрь» и несколько полотен с видами Шотландии уже значительно отличались от стиля последователей «Школы маккьяйоли». Постоянно изменяющийся ритм жизни художник стремился передать в картинах «Лит» и «Холмы острова Эльба».
После того, как работы была закончены, художник впечатлился видами Сеттиньяно и в разное время написал несколько пейзажей, посвященных полюбившемуся месту. Так появились картины «На холмах Сеттиньяно», «Площадь Сеттиньяно» и «Хрупкие оливковые деревья Сеттиньяно». На этих полотнах статичные крупные пятна цвета были заменены на резкие и динамичные мазки, на них также появился четкий темный контур, который очерчивал изображенные силуэты.
От «болезни» французским импрессионизмом Синьорини избавился только ближе к 1890 году. В период возвращения к своим художественным истокам Телемако написал картину «Тюрьма в Портоферрайо», которая отличалась если не живописностью, то психологизмом и манерой исполнения.
А позднее художник вернулся к написанию пейзажей в пленэрной манере «маккьяйоли». Тогда Синьорини жил в горных поселках Пьянкастаньо и Пьетремала и испытывал влияние Дега, с которым состоял в очень доверительных дружеских отношениях.
Именно он вдохновил Синьорини на создание картины «Утренний туалет», исполненной в духе знаменитых тосканских живописцев.
Помимо художественной деятельности Телемако Синьорини был известен как талантливый литератор. Им были написаны книги «Карикатуристы и карикатурируемые в кафе «Микеланджело» и «Девяносто девять дискуссий художников», которые сегодня исследователи считают ценными документальными свидетельствами о существовании и деятельности «Школы маккьяйоли». Прославился Синьорини еще и как профессиональный публицист, ведь с 1867 года он был издателем полемического журнала Gazzettino degli arti del disegno, в котором публиковались статьи художника о современном итальянском и зарубежном искусстве.